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教你用熒光定量PCR儀(ABI 7500)

更新時間:2024-12-06點擊次數:1673

打開電腦及儀器電源,雙擊電腦桌面上的7500 software圖標打開程序。


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圖片來源:網絡


軟件主界面:


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圖片來源:7500/7500 Fast Real-Time PCR System GETTING STARTED GUIDE


實驗設置:


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a.實驗名稱

b.儀器型號

c.實驗目的:定量、Genotyping(基因分型)、定性(有/無)


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d.定量類型:標準曲線、相對標準曲線、相對定量

e.實驗方法:探針法、染料法

f.模板類型:gDNA、cDNA



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g.Target設置:Target包括目的基因、內參基因(多少個和名稱)。


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探針法需要選擇使用的熒光基團和淬滅基團。

h.標準曲線設定:幾個點、每點幾個重復、定義標準量范圍。


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圖片來源:qPCR進階攻略——帶你玩轉qPCR儀器設置!-Yeasen


i.樣本設置:Sample包括實驗組、對照組、負對照組;樣本數、每樣本重復數、陰性對照數、樣本選擇和命名。


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j.反應孔的設置:根據樣品的排布選中面板上的加樣孔,勾選左邊對應的目的基因及模板。


注意:不應為了方便將所有孔選成同一個Target同一個Sample,這樣排布會造成比較大的風險。我們通過下面的例子進行說明:


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圖片來源:qPCR進階攻略——帶你玩轉qPCR儀器設置!-Yeasen


我們同一塊板上同時擴增兩個基因,而布孔時選成同一個Target,那么儀器默認的都是同一個閾值,假如布孔時都選成Target1,紅色這條閾值線對于Target1是合理的,但對于Target2則不合理,因為這時已經不在指數擴增期,得到的Ct值并不可信。


反應程序設置:PCR反應程序的設置要根據不同公司的Master Mix。比如BioTeke的95℃ 2分鐘就可以激活DNA聚合酶(ABI的需要10分鐘)。


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a.反應體系設置:


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反應體系的配制,不得不說到參比/校正染料(reference dye,passive dye)。常用的是ROX或者其他染料,只要不影響檢測PCR產物的熒光值就可以。


參比染料的作用是標準化熒光定量反應中的非PCR震蕩,校正加樣誤差或者是孔與孔之間的誤差,提供一個穩定的基線。現在很多公司已經把ROX配制在MasterMix或者Premixture里,也有的是單獨分開。如果反應曲線良好或已經優化好反應體系,也可以不加ROX染料校正。比如Bio-RAD的系列儀器就不需要。


需要注意一點ABI儀器的需要加ROX參比染料的,默認的是ROX,要根據不同公司的MasterMix進行這一個步驟的選擇。如BioTeke的MasterMix里沒有參比染料,所以選擇“none"。



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b.兩步法或三步法:qPCR反應可以將退火與延伸兩步進行合并,條件需要根據引物和目的基因的長度進行調整,根據qPCR引物設計原則,引物的Tm值在60℃左右,因此這一步的溫度一般可設為60℃。


c.熒光信號采集:對于染料法而言,兩步法檢測的熒光信號采集應該在退火延伸的整合步驟;三步法應當在72℃延伸時采集,此時絕大部分的DNA是雙鏈狀態;Taqman法則一般在退火結束時或延伸結束采集信號。以ABI 7500為例,選擇在哪一步采集熒光信號點亮其下面的小方塊即可。



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d.熔解程序:使用染料法進行熒光定量PCR時,我們通常會在擴增階段完成后進行熔解曲線分析,幫助確定產物類型,判斷是否有非特異性擴增的產生。


以SYBR Green法為例,SYBR Green染料只有結合到雙鏈DNA的小溝中才能發出熒光,擴增反應完成后,對產物逐漸升溫同時監測每一步的熒光信號,隨著溫度升高,DNA雙鏈解開,產物熒光信號下降。



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溶解曲線程序采用儀器默認設置就可以。或者是儀器說明書上建議的程序。溫度一般設置在60℃-95℃區間,能包含產物Tm值和非特異產物Tm值即可。在某個溫度下,雙鏈DNA會解鏈一半,此后剩下的一半會迅速解鏈,熒光驟降并形成變化的拐點,這個溫度稱為退火溫度(Tm值)。將溫度與熒光強度的變化求導作圖(-dI/dT),從而生成熔解曲線。


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圖片來源:qPCR進階攻略——帶你玩轉qPCR儀器設置!-Yeasen


RUN:全部設置好之后,就可以把配置好的PCR管放進儀器,點擊RUN!


數據分析:



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